液相色谱法测定饲料中黄曲霉素B1

丁　平　侯亚莉　程晓伟　重庆市饲料兽药监察所

　　黄曲霉素是黄曲霉与寄生霉素产生毒株的代谢产物,它是化学结构相似的一类化合物,根据其结构的差异分别被称为黄曲霉素B1 、B2 、G1 和G2 等,其中以黄曲霉素B1 zui为常见,也是已知zui强的化学致癌物之一,对粮油食品的污染较为严重。饲料检测
中常以黄曲霉素B1 为指标,我国的饲料*通常为10～50μg/ kg。国内外有关黄曲霉素B1 的检测方法主要有:薄层色谱法、酶联免疫测定法、液相色谱法和荧光光度法。试验采用了免疫亲和柱对饲料中黄曲霉素B1 进行净化,对液相色谱荧光检测方法进行了研究,为监控饲料中黄曲霉素B1 提供了简便可行的方法。
1 　材料与方法
1. 1 　仪器和试剂
仪器　Angilent 1100 液相色谱仪,2475 多波长荧光检测器,METTLER AE 240 电子天平,振荡器,涡旋混合仪,微孔虑膜（0. 45μm） ,玻纤滤纸,免疫亲和色谱柱（北京安易世纪贸易有限公司提供） 。
试剂　黄曲霉素B1 标准溶液（1 mg/ L） ,由Sig2ma 公司提供,三氟乙酸,甲醇（色谱纯） ,水为超纯水。

1. 2 　溶液的配制
1. 2. 1 　样品提取液取550 mL 甲醇,用水定容至1 000 mL ,混匀。
1. 2. 2 　流动相取450 mL 甲醇,用水定容至1 000 mL ,混匀。
1. 2. 3 　黄曲霉素B1 衍生标样的配制分别准确吸取一定量的标准准备液,置于5 mL玻璃试管中,在50 ℃水浴锅N2 流下吹干,加300μL的衍生化试剂三氟乙酸进行衍生,在室温下放置3 min。在50 ℃水浴锅N2 流下吹干,用1 mL 甲醇、乙腈和水等体积混合的溶液溶解,配置成浓度为1、
2、5、10 和20 μg/ L 的标准溶液,分别进行HPLC 检测。
1. 3 　样品的处理
准确称取样品5. 0 g ,置于150 mL 具塞锥形瓶中,加入1. 0 g 氯化钠和40. 0 mL 样品提取液,往复振荡30 min ,用玻纤滤纸过滤。准确移取10. 0 mL滤液并加入30. 0 mL 水稀释,注入已用水平衡至室温的IAC 小柱,用3 mL 水淋洗,用3 mL 甲醇洗脱,收集洗液置玻璃试管中,在50 ℃水浴锅N2 流下吹干。按标准品衍生方法处理后进行HPLC 检测。
1. 4 　回收率的测定
称取空白饲料5. 0 g ,置于150 mL 具塞锥形瓶中,分别加入标准工作溶液,使样品中药物浓度分别为20. 0 、10. 0 和2. 0μg/ kg ,混匀后静置10 min ,每个浓度水平设4 个平行,按1. 3 的方法分别处理和测定。
1. 5 　色谱条件
色谱柱　C18 柱,250 mm ×4. 6 mm ,粒径5μm;柱温25 ℃;流动相450 mL 甲醇+ 550 mL 水;激发波长365 nm;发射波长435 nm;进样量25μL 。
2 　结果与分析
2. 1 　测定方法的线性响应
取配置好的标准溶液在选定的色谱条件下进行测定, 绘制标准曲线（ 见图1） 。在浓度为1 ～50μg/ L时拖尾峰（tailing peak）。前者少见。>色谱峰面积与浓度呈线性相关,其回归方程为y = 2. 524 1 x + 0. 272 2 ,相关系数r2 = 0. 999 8。其线性响应范围*测定的要求,表明该方法定量测定可靠。

2. 2 　测定方法的灵敏度
在试验条件下,按信噪比（S/ N） 为3 计算,求得饲料中黄曲霉素B1 的检测限为0. 01μg/ kg ,按S/ N为10 计算,求得饲料中黄曲霉素B1 的定量限为0. 03μg/ kg ,满足定量分析的要求。
2. 3 　添加回收率试验
添加回收率及结果的变异系数见表1。标准品、空白饲料样品及添加标准品的饲料样品的色谱图见图2 ,本方法条件下黄曲霉素B1 的保留时间约为8. 3 min。
从表1 可以看出,在3 个饲料添加水平下,黄曲霉素B1 的平均回收率为74. 9 %～81. 6 % ,变异系数为0. 01 %～0. 04 %。

3 　讨论
       本方法采用甲醇- 水提取饲料样品,通过IAC柱净化浓缩,以HPLC 荧光检测法测定黄曲霉素B1的含量。从空白饲料样品的色谱图和添加饲料样品的色谱图可以看出,黄曲霉素B1 色谱峰附近没有杂质峰,说明饲料中的杂质对本测定方法没有干扰。
从表1 看出, HPLC 法有较高的回收率（ 平均77. 5 %） 和良好的重现性（平均变异系数0. 03 %） 。由于黄曲霉素的毒性很大,现在对黄曲霉素的*达到2～4μg/ kg 以下甚至更低。对黄曲霉素含量的*越低,表明对检测仪器和方法的要求越高。复杂的操作、大量的有机试剂、严格的防护条件及对操作者的损害等都不适合形势发展的要求。试验用免疫亲和色谱- HPLC 法代替了常用的薄层法,减少了操作步骤和有机溶剂的损耗。国标食品中黄曲霉素的测定采用柱后衍生化HPLC - 荧光光度法,试验采用了这一方法,对仪器的要求降低了。
        试验研究了进样体积对黄曲霉素B1 峰型的影响,当进样量为100μL 时,样品峰的峰型很不对称,有前延峰。后改用50μL 的进样量时,峰型得到很大的改变,也很对称。由于25μL 进样时也能满足定量的要求,试验zui后确定进样量为25μL 。在样品提取时,振荡的时间应足够,刚开始试验时,提取时间是15 min ,回收率很低,不能满足定量的要求。当振荡时间延长为30 min 时,回收率得到较大的提高,能满足饲料检测的要求。
试验结果表明,免疫亲和色谱—HPLC 法操作简便易行,能满足分析的要求,是测定饲料中黄曲霉素B1 的一种灵敏且可靠的方法。

参考文献
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